本发明公开一种重组腺病毒表达自组装呼吸道合胞病毒样颗粒,所述病毒样颗粒包含呼吸道合胞病毒F和M蛋白,所述F和M蛋白是密码子优化的F和M基因进行编码,F和M基因由2A序列连接,所述连接后的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明还公开了上述呼吸道合胞病毒样颗粒的制备方法及在制备用于预防或治疗呼吸道合胞病毒感染疫苗或药物、呼吸道合胞病毒抗体和呼吸道合胞病毒的诊断试剂中的应用。本发明采用单一重组腺病毒为载体,建立了一种体内自组装表达呼吸道合胞病毒样颗粒的方法,重组腺病毒制备相对简单、显著降低成本,获得较好的免疫效果及免疫保护,并且提供了安全性。