本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus(Berk et Curt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(Allesch et Schnabl)Imaz)中六氢-7-羟基-3-(2-甲基丙基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物,然后进行正相硅胶层析,采用氯仿与甲醇洗脱,然后是甲醇凝胶层析,经HPLC检测后,进行高压反相制备,经HPLC检测,适当合并洗脱液,减压干燥,即得六氢-7-羟基-3-(2-甲基丙基)吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。