本发明涉及医药生物技术领域,具体涉及一种问号钩端螺旋体DNA疫苗及其构建方法和应用。问号钩端螺旋体可经皮肤或黏膜迅速侵入人和多种动物体内引起感染,人类感染后引起以发热、黄疸、出血为主要症状的钩体病,是一种世界分布广、严重威胁人类健康和畜牧业生产的、常见的人兽共患病,中国是钩体病主要流行国家之一。本发明提供了一种问号钩端螺旋体DNA疫苗,该DNA疫苗由真核表达载体和问号钩端螺旋体LB018基因组成,所述的LB018基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明能有效地诱发仔猪的免疫应答反应,说明其对动物的问号钩端螺旋体感染有一定免疫保护作用;且生产工艺简单,成本低廉,理化性质稳定、便于储存和运输。