本发明涉及生物技术领域,具体来说是一种检查黑麦染色体的寡核苷酸探针及该探针的制备方法,探针序列如SEQ ID NO:1所示;获得方法包括:(1)用Slaf-seq方法对黑麦基因组DNA进行测序,获得大量长度为120bp的reads;(2)用生物信息学方法从测得的序列中找到高度重复的序列,从这些高度重复的序列中,选取长度在60bp以下的寡核苷酸,用作探针合成;(3)将初步筛选出的寡核苷酸序列送到公司进行探针合成;(4)探针合成后,逐条进行FISH试验,验证探针的功能;(5)确定正确的寡核苷酸探针。本发明获得的探针序列能起到应有的功能,使鉴定小麦背景中的黑麦染色体的实验变得简便易行,且实验成本大大降低。