本发明公开了一种siRNA植物基因表达载体及其构建方法和应用。本发明siRNA植物基因表达载体的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明siRNA植物基因表达载体是将高粱花叶病毒复制酶基因、甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因序列串联,再以水稻糯性α基因内含子为中间连接序列,将上述串联体连接为反向重复序列,插入植物表达载体pCAMBIA-1300的多克隆位点,得到一个由35S启动子驱动的表达上述三种病毒siRNA的植物基因表达载体。利用本发明siRNA植物基因表达载体转化植物受体材料,可以获得同时抗高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的转基因植株或材料,应用于农业生产中,可以提高植株的抗病毒能力和生存能力。