本发明公开了一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44b及其定点突变方法与应用。所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44b的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;采用CRISPR/Cas9技术,设计1个sgRNA靶位点,位于距离终止密码子,通过转化烟草造成该基因在目标位点的突变;通过自交收种后,筛选得到了NtMYB44b基因定点纯合突变后代。生理实验表明突变烟草叶片失水速率显著慢于野生型的对照植株。干旱胁迫后的覆水实验表明突变植株存活率显著高于野生型植株。本发明表明利用CRISPR/Cas9技术针对NtMYB44b基因尾部所创制出的NtMYB44b基因纯合突变烟草材料比野生型烟草具有更高的抗旱能力,并为应用于烟草抗旱育种提供基因资源与技术支持。