本发明公开了可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白的制备方法和应用，制备方法如下：将SEQ ID NO.3所示序列的第9～1376位核苷酸连接于pET‑32(a)+载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌Rosetta、BL21或BL21(DE3)PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，加入IPTG至终浓度为0.2～1.0mmol/L，在温度为20～39℃诱导表达4～12h；制得的I型鸭肝炎病毒3D蛋白为可溶性，并且有免疫原性，能够刺激鸭体产生抗I型鸭肝炎病毒3D蛋白的抗体，能够用作检测I型鸭病毒性肝炎的血清样本或含抗I型鸭肝炎病毒3D蛋白抗体的试剂，对I型鸭病毒性肝炎的诊断和疫苗的研究具有重要意义。
