According to the present invention, by including a step of culturing a population of cells containing mesenchymal stem cells in the presence of a fibronectin fragment, a large amount of mesenchymal stem cells are produced in a short time in a medium containing no heterogeneous component.본 발명에 의하면 중간엽 줄기세포를 함유하는 세포집단을 피브로넥틴 프래그먼트의 존재하에서 배양하는 공정을 포함함으로써, 이종 유래 성분 불포함 배지에서 단기간에 대량의 중간엽 줄기세포가 제조된다.