本发明涉及生物信息技术领域,公开了一种利用ISSR指纹图谱鉴定咖啡种质资源的方法。该方法将标准咖啡品种DNA用SEQ ID NO:1和/或2所示序列引物进行PCR扩增,根据扩增产物的凝胶电泳结果以咖啡品种编号和条带存在位点编号为横、纵坐标,在每一横、纵坐标交结处记录标准咖啡品种条带的检测结果,得到标准咖啡品种的ISSR指纹图谱;将待测咖啡品种DNA用同样引物PCR扩增,扩增产物按上述方法构建待测咖啡品种的ISSR指纹图谱,并与标准咖啡品种的ISSR指纹图谱比对判断。本发明应用ISSR分子标记技术从遗传本质上对咖啡种质资源进行了准确鉴定,解决了咖啡种质鉴定困难的问题,且简单、易操作,检测迅速。