本发明公开了一种钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶及其编码基因与应用。该钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶,其氨基酸序列为以下之一:(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列;或(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明首次从钝鳞紫背苔克隆得到1个可以高效催化黄酮六位羟基甲基化的氧甲基转移酶,体外酶活功能鉴定证明PaF6OMT最适底物是黄芩素和野黄芩素。反应时间和蛋白量对底物转化率的影响的实验证明在合适的蛋白量和一定的反应时间内,可完全催化黄芩素和野黄芩素分别生成千层纸素A和高车前素。