The present invention provides a chromatographic separation process for recovering a polyunsaturated fatty acid (PUFA) product from a feed mixture, which comprises: (a) purifying the feed mixture in a first chromatographic separation step using as eluent a mixture of water and a first organic solvent, to obtain an intermediate product； and (b) purifying the intermediate product in a second chromatographic separation step using as eluent a mixture of water and a second organic solvent, to obtain the PUFA product, wherein the second organic solvent is different from the first organic solvent, and wherein the first chromatographic separation step comprises introducing the feed mixture into a simulated or actual moving bed chromatography apparatus and the second chromatographic separation step comprises introducing the intermediate product into a stationary bed chromatography apparatus.Cette invention concerne un procédé de séparation chromatographique qui permet de récupérer un produit d'acide gras polyinsaturé (PUFA) à partir d'un mélange d'alimentation, ledit procédé comprenant : (a) la purification du mélange d'alimentation dans une première étape de séparation chromatographique utilisant à titre d'éluant un mélange d'eau et d'un premier solvant organique, pour obtenir un produit intermédiaire； et (b) la purification du produit intermédiaire dans une seconde étape de séparation chromatographique utilisant à titre d'éluant un mélange d'eau et d'un second solvant organique, pour obtenir le produit PUFA. Le second solvant organique est différent du premier et a un indice de polarité qui diffère de celui du premier solvant organique d'une valeur comprise entre 0,1 et 2,0, le produit PUFA étant autre qu'un acide alpha-linolénique (ALA), un acide gamma-linolénique (GLA), un acide linoléique, un mono-, un di- ou un triglycéride ALA, un mono-, un di- ou un triglycéride GLA, un mono-, un di- ou un triglycéride d'acide linoléique, un ester d'alkyle C1-C4 ALA, un ester d'a
