本发明涉及金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽及其制备方法和应用,具体地,本发明提供一种金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:17、35和42所示。其对应的核心表位的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:48、54和69所示。本发明用重叠肽结合滴定法鉴定金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞优势免疫表位,筛选方法简便快速、准确无遗漏。所述免疫优势表位不含有不必要甚至有害的部分,从而降低由其所制备的疫苗的使用风险,具有较大的疫苗应用价值,可用于制备金黄色葡萄球菌肠毒素B表位疫苗和/或预防疫苗。