本发明公开了一种稳定表达马尔堡包膜糖蛋白的复制型4型腺病毒载体重组病毒的制备方法及在预防马尔堡病毒病疫苗中的应用。所述重组病毒具有与人4型腺病毒(Human Adenovirus type 4,HAdV‑4 or Ad4)完全一致的颗粒结构,基因组中完全缺失腺病毒E3区,外源基因表达框嵌入腺病毒基因组包装信号之后、E1区序列之前,感染细胞后可以稳定表达马尔堡病毒Angola株包膜糖蛋白。该重组病毒免疫动物后,能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞免疫和体液免疫反应,能够在一定程度上应对世界范围内5型腺病毒载体重组疫苗预存免疫水平较高的问题。此外,该疫苗制备方法简单,可在短期内大规模生产,用于应对突发马尔堡病毒疫情和生物恐怖袭击。