本发明涉及水稻鉴定领域,特别涉及一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法,以碱基序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示中的任一种或多种设计引物进行基因扩增鉴定。该鉴定方法是以水稻线粒体基因组遗传变异为基础,先将D1型水稻细胞质不育系的线粒体提取并测序,然后与其他水稻品种进行基因组学分析,筛选出3个特异性强的东野型不育系D1A线粒体特异序列;以该序列设计引物,然后通过分子检测手段,来鉴定是否为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合特异的标记。该鉴定方法能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合;并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠。