本发明属于兽药残留分析技术领域。具体涉及利用突变蛋白检测β‑内酰胺类抗生素残留的方法。该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1,在序列的55,70和563‑564位存在等位基因突变。公开了如SEQ ID NO:2所示蛋白质序列的突变蛋白同时对40种β‑内酰胺类抗生素残留的检测方法,包括:突变位点的设计,构建突变蛋白,对突变蛋白进行诱导表达及纯化,利用突变蛋白建立β‑内酰胺类抗生素残留的检测方法。本发明对35种β‑内酰胺类抗生素测定方法提供了最低检测限、样品回收率及变异系数等技术参数,对本发明的检测方法做了准确度和重复性验证分析,本发明能同时检测35种动物性食源产品中β‑内酰胺类抗生素的残留量。