本发明公开了一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶,含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的分子量为33.03kDa;所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的等电点为5.28;纤溶活性为10000±1000U/mg。本发明还提供了上述双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法,对双齿围沙蚕进行预处理,然后将粗双齿围沙蚕酶经凝胶柱层析、凝胶过滤及超滤法脱盐,离子交换柱层析及电泳制备可得到一种纤溶活性强的纤溶蛋白酶,可作为用于治疗血栓疾病的原料药。本发明的方法操作简便,可控,用本发明方法可制得纤溶活性高且纯度高的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶。