本发明公开了表达猪肺炎支原体P102蛋白的重组腺病毒及其应用。本发明首先将猪肺炎支原体P102蛋白的基因进行突变,将突变后的全基因(SEQ ID NO:1)克隆到穿梭载体pShuttle-CMV上,得到重组穿梭载体;经线性化后电转化入内含腺病毒骨架载体的感受态细胞中,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒。重组腺病毒经间接免疫荧光和Western Blot鉴定证明该重组腺病毒成功表达了P102蛋白。将本发明重组腺病毒以肌注和滴鼻两种途径免疫6~8周龄雌性Balb/c小鼠,重组病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和胞免疫应答,表明本发明重组腺病毒可应用于猪支原体肺炎的诊断、预防或治疗。