本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体、重组腺病毒、方法及应用,其中,所述表达非洲猪瘟病毒p34基因的重组腺病毒载体包括腺病毒骨架载体和插入腺病毒骨架载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒p34基因,所述p34基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述腺病毒骨架载体为pAd5;其中,所述重组腺病毒由本发明所公开的重组腺病毒载体转染哺乳动物细胞所获得。本发明首次利用重组腺病毒表达系统表达非洲猪瘟病毒的p34蛋白,实现了p34蛋白的高水平表达,为非洲猪瘟病毒核酸疫苗的研制提供了病毒模型,为进一步开发基因工程疫苗奠定了基础。