本发明提供一种口蹄疫疫苗粘膜免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法,属于生物制药领域。该粘膜免疫增强剂含有质量比为(0.2‑4):1的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和不耐热肠毒素B亚基,所述非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白、不耐热肠毒素B亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明还提供一种口蹄疫疫苗,含有灭活的口蹄疫病毒、25‑80μg/mL非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白和25‑80μg/mL不耐热肠毒素B亚基。本发明粘膜免疫增强剂,能够显著提高免疫动物对抗原的免疫应答,尤其是黏膜免疫应答;含有所述免疫增强剂的灭活疫苗免疫后能够诱导高滴度IgG和sIgA,免疫效果好。