本发明属于生物技术和植物基因工程技术领域,公开了一种Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用,所述Gateway克隆系统的植物表达载体分别为PKGMYC,PKNYFP和PKCYFP;PKGMYC的序列为SEQ ID NO:1;PKNYFP的序列为SEQ ID NO:2;PKCYFP的序列为SEQ ID NO:3。本发明以pK7GWIWG2D(II),0或pK2GW7为骨架,这两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切;通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入这两个载体,形成以卡那霉素为筛选标记的植物表达载体;同时,pK7GWIWG2D(II),0为骨架的改造载体还具有非融合的GFP荧光蛋白筛选标记。