本发明公开了一种用于检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。所述ELISA试剂盒包括包被抗原、兔抗鱼IgM二抗、HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液;所述包被抗原为鱼类无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白,其中ScpB蛋白片段序列为与SEQ ID NO:1至少80%同源的序列;通过鱼特异性IgM的制备、兔抗鱼IgM抗体的制备、抗原的制备、试剂盒组装等步骤制备而成。本发明所述的检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒,用于检测鱼类无乳链球菌IgM抗体,具有高特异性。