本发明公开一种用于检测犬源锡兰钩虫和犬钩虫的SNP分子标记ITS296、Tm‑shift引物及其应用。该SNP分子标记ITS296位于SEQ ID NO:1所示的第296位碱基T或G,此处碱基为T的为锡兰钩虫,此处碱基为G的为犬钩虫。基于SNP位点ITS296设计的引物能对锡兰钩虫与犬钩虫进行准确鉴定;两者Tm值的CV分别为0.13%与0.07%;当锡兰钩虫与犬钩虫样品稀释度低至1:107时,仍可进行区分;对10份已知钩虫待检DNA样本的检测结果与已知种完全一致;对临床样品的检出率明显高于镜检,准确率与测序结果完全一致。该技术可用于犬源钩虫的种类鉴别和分子流行病学调查以及钩虫病爆发的风险评估。