本发明提供了一组胰蛋白酶核酸适配子及其制备方法和应用,还提供了一种胰蛋白酶反应器及其制备方法,属于生物技术领域。针对现有技术中尚无胰蛋白酶核酸适配子的缺陷,提供了一组胰蛋白酶核酸适配子,其核苷酸序列选自序列表中SEQ ID No.1~SEQ ID No.25;是通过SELEX技术结合表面修饰的磁珠对原始随机寡核苷酸文库进行筛选、扩增、测序制备得到;可用于检测、分离、纯化以及固定化胰蛋白酶,制备生物感应器,分析检测目标物质和制备用于临床诊断试剂和疾病治疗药物,还可用于制备胰蛋白酶反应器。所述核酸适配子分子量小,可以化学合成,成本低;亲和性和特异性强;便于标记;重复性和稳定性好,易于保存。