本发明提供一种携带猪肺炎支原体P216基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用,将肺炎支原体P216基因插入骨架质粒中,形成携带目的基因的重组腺相关病毒DNA载体质粒,将重组腺相关病毒DNA载体质粒、可提供AAV2的复制蛋白和AAV5的外壳蛋白的包装质粒与辅助质粒共转染宿主细胞,进而获得携带P216基因的重组5型腺相关病毒载体rAAV5‑P216,所述P216基因的序列如SEQ ID NO:1所示。上述重组病毒载体具有靶向性、特异性、应激反应小、高感染效率等优点,可被广泛应用于制备抗猪肺炎支原体感染以及预防相关疾病的疫苗或药物中,生产方便,使用简单。