本发明提供一种用于分析大豆镰孢根腐真菌多样性的特异性引物组、试剂盒及其应用,涉及生物检测领域,其由:具有如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物;具有如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物;具有如SEQ ID NO.3所示的第三正向引物;具有如SEQ ID NO.4所示的第四正向引物中的一种或多种,以及具有如SEQ ID NO.5所示的共用反向引物组成。将本发明的特异性引物应用于由镰孢菌引起的大豆根腐病的检测可以快速分辨出引起大豆根腐病的镰孢菌,并根据检测结果所显示的条带大小确定镰孢菌的种类,从而为大豆根腐病的综合防治提供依据。