本发明属于基因工程领域,具体涉及一种抗CD123人源化单链抗体及其应用。本发明的识别CD123抗原的单链抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7所示,所述单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8所示。本发明提供了稳定适合的抗CD123人源化单链抗体(scFv),其用于制备CAR结构,既保留了scFv的结合特异性和亲和力,又保证了CAR‑T在体内的的稳定性和安全性。在免疫细胞中表达后,不仅可以有效的清除表达CD123抗原的肿瘤靶细胞,而对阴性抗原(不表达CD123)的肿瘤细胞没有毒性作用;并且能够维持靶向CD123的CAR在病人细胞培养过程中的阳性率,在靶抗原刺激后能够长时间的进行增殖,能够用于肿瘤的靶向治疗。