本发明公开了一种利用分子标记选育洋葱雄性不育系和保持系的方法:利用特异性引物(如SEQ ID NO.1~6所示),通过PCR实验检测单个洋葱球核质基因型,筛选获得不育株和保持株洋葱球,实现两系配套。本发明根据Ms等位基因侧翼序列(F1890和S1887)与洋葱细胞质雄性不育特异序列mt472,设计多套引物,通过科学实验开发了基于多重PCR的分子标记检测系统及检测试剂盒。该检测系统能够通过一次PCR实验区分洋葱6种核质育性类型,然后利用此检测系统,从开放授粉群体内直接选育不育系和保持系,实现两系的一次性配套。该多重PCR检测系统的开发为洋葱核质互作雄性不育核质基因型的准确、快速鉴定具有重要意义。