本发明涉及一种检测牛单精子性别或牛分离精液中X、Y精子纯度的引物及其应用。所述引物包括SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列,本发明利用上述引物采用快速PCR方法进行扩增检测,利用两个染色体特异扩增产物长度的差异通过琼脂糖凝胶电泳结果进行单个精子性别鉴定;通过对分离精液中分离的各单个牛精子进行简单PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,然后根据对单个精子性别检测结果的统计分析,对分离精子纯度做出最终评价。该方法在任意精子细胞中均能扩增出特异PCR产物,不需设计内标引物,是一种成本低廉,操作简便、快速、准确的鉴定牛X、Y精子分离纯度的技术,为后续性控精液的推广应用及精子分离方法的优化与创新提供了可靠、必要的技术支持。