本发明涉及一种半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段及其应用。半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA片段,其特征在于所述的DNA片段为:(a)、具有序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA片段;(b)、分别与(a)中所述DNA片段经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的DNA片段,且为半滑舌鳎雌性特异的基因组DNA序列。本发明获得的半滑舌鳎雌性特异性的DNA片段作为分子标记能够有效的辨别半滑舌鳎的雌性个体,并且本发明的方法可以一次性鉴定大量个体,鉴定时间不超过90分钟,适合大规模地进行半滑舌鳎的遗传性别鉴定,能够在半滑舌鳎工厂化养殖中进行大规模的推广。