本发明提供一种用于检测烟草对TMV抗性的N基因特异性引物对、检测方法及试剂盒,特异性引物对包括上游引物和下游引物;上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。检测方法为:在烟草N基因序列特异区域设计一对特异性引物;以待测烟草品种的DNA为模板,使用N基因特异性引物对进行PCR扩增;采用电泳检测PCR扩增产物,判断PCR扩增产物是否含有865bp的特征条带,如果含有,则对TMV具有抗性;反之,则不具有N基因介导的TMV抗性。具有操作简便、结果可靠、检测速度快等优点,能够极大地加速抗TMV育种材料的选育过程,缩短育种周期,提高育种效率。