本发明公开了一种青霉素G酰化酶突变体及其在合成头孢类抗生素中的应用。所述青霉素G酰化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了所述的青霉素G酰化酶突变体在合成头孢克洛中的应用。本发明提供了一种新的青霉素酰化酶突变体,与野生型相比,青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素如头孢丙烯、头孢克洛或头孢羟氨苄时具有更高的活性,尤其是催化7-ACCA和苯甘氨酸甲酯合成头孢克洛,比活力由原先1.2U/mg提升到29.8U/mg,且合成水解活力与野生型几乎一致,合成水解比可达1.7,头孢克洛的产率可达71.5%。