Comprising introducing a CRISPR-Cas system capable of generating three or more guide RNAs and Cas proteins per target gene in cells having one or more target genes, wherein the target gene is knocked out Production method. The present invention can provide a method capable of producing knockout animals of two alleles of the whole body at high efficiency (90% or more) in one generation.１種以上の標的遺伝子を有する細胞中に、前記標的遺伝子１種につき３種以上のガイドRNAとCasタンパク質とを生成できるCRISPR-Casシステムを導入することを含む、標的遺伝子がノックアウトされた細胞の製造方法。本発明は、一世代において全身の２対立遺伝子のノックアウト動物を高効率(９０％以上)に作製できる方法を提供することができる。
