本发明涉及利用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法。本发明的口蹄疫病毒毒株,其VP3和VP1结构蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4中第304-736位氨基酸残基所示。实验证明,将本发明得到的突变病毒株制成疫苗,可以同时抗中国型O/TL/Taiwan/97谱系猪源流行毒、泛亚型O/China/99谱系猪源流行毒和东南亚型缅甸98谱系O/GS/2010猪源流行毒的侵害,具有抗原普广的特性,免疫猪,能明显提高对抗原性有差异的同型口蹄疫病毒攻击的保护率,达到交叉保护的免疫效果,在预防和控制口蹄疫中将发挥重要作用。