本发明提供了一种用于检测EB病毒Rta/IgG抗体的化学发光试剂盒及其应用,属于生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域。所述化学发光试剂盒包括包被有抗His标签单抗的磁颗粒,携带His标签的Rta蛋白,携带His标签的特异性人工多肽及吖啶酯标记的抗人IgG抗体;所述特异性人工多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了基于所述化学发光试剂盒的检测EB病毒Rta/IgG抗体的方法。采用本发明所述的化学发光试剂盒及检测方法能够快速、准确、高效、灵敏、特异地检出待测样品中存在的EB病毒Rta蛋白抗体,同时能实现多样本处理,缩短了检测时间,提高了检测效率。