本发明公开了一种用于检测五常大米主要品种的引物对、检测试剂盒及其检测方法,所述引物对,包括:特征DNA片段S48‑468引物对,核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;特征DNA片段S75‑632/692引物对,核苷酸序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;特征DNA片段S43‑1000引物对,核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;特征DNA片段SBE1引物对,核苷酸序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;特征DNA片段S73‑2438引物对,核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。本发明可实现通过一次多重PCR反应进行五常大米主要品种鉴定的目的,从而实现对五常大米品种的快速检测。