本发明提供了检测人二倍体细胞DNA的试剂盒及其应用。本发明通过对人细胞基因组序列比对,确定了高度保守的Alu序列,该序列在各种不同来源的人胚肺二倍体细胞中高度同源,本发明以该保守区为靶序列设计了用于检测人二倍体细胞的引物对和探针,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。本发明还提供了对人二倍体细胞DNA进行实时荧光定量PCR检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测试剂盒具有检测准确,灵敏度高、特异性强,简便快速的优点,适用于目前已知的所有人胚肺二倍体细胞DNA检测,且成本低廉,既可用于临床检测也可用于生物制品生产过程的质量控制,具有良好的经济价值和应用前景。