本发明公开了一种预防流行性乙型脑炎的DNA疫苗。其中,该DNA疫苗以真核表达质粒融合SEQ ID No.1所示的抗原编码基因构建得到。本发明优化后得到的prM/E同义序列,符合适宜人体高表达且利于DNA疫苗的合成和应用。本发明所构建的JEV DNA疫苗与现有DNA疫苗相比,该质粒携带抗原序列精简,保护性位点集中,不含神经毒性位点,安全性高,经密码子优化后更适于人类细胞的高表达,引入JEV信号序列,可进一步提高表达效率和目的蛋白的正确折叠和定向转运。免疫效率更高,免疫时效更持久,可尽量少的避免因疫苗诱导的免疫力衰减而造成的发病率上升的现象,以进一步缓解我国公共卫生压力。