本发明的所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物,由以下1对引物组成:HRM‑Ⅱ‑F:5'CACCGGAGTTAAACTTCATCGC‑3'(SEQ ID NO:1);HRM‑Ⅱ‑R:5'CCTGTGGCAGACCGGCAGATAA 3'(SEQ ID NO:2);根据草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和已知的Ⅱ型野毒株S2基因5’端和3’端保守区域设计而获得,疫苗株和野毒株扩增产物之间存在一个或多个固定的碱基突变位点,这些突变位点为疫苗株所特有,满足HRM对于的GCRV Ⅱ型疫苗株和野毒株的鉴定分析,同时本发明还根据所述基于高分辨率溶解曲线(HRM)的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型疫苗株和野毒株鉴别诊断检测引物设计出相应的检测试剂和以及检测方法,提高该技术的实用性能。