本发明涉及生物技术和DNA疫苗领域,具体提供一种治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗、及其制备方法及与应用。治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗(简称TB DNA疫苗)为含有编码外源免疫保护性抗原蛋白Ag85a-ESAT6的融合基因表达载体,其由5’端带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAX1载体后得到。所述信号肽能够提高抗原蛋白的分泌,增强其免疫效果。本发明利用基因重组技术构建包含多个免疫保护性抗原的融合基因结核分枝杆菌DNA疫苗,通过在体电脉冲技术(in vivo electroporation,EP)将DNA疫苗注射小鼠双侧胫前肌,可诱导针对结核抗原分泌高水平IFNγ的Th1型免疫应答和特异性杀伤应答,是一种可预防和治疗结核病的疫苗。