本发明提供用于检测猪Delta冠状病毒抗体的多肽、制备方法及其应用,涉及生物技术领域。该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,制备方法包括将含有所述多肽编码基因的重组菌在35‑40℃条件下采用IPTG诱导表达的步骤,所述重组菌是将所述多肽编码基因插入pcold 1 质粒后导入大肠杆菌获得的。检测猪Delta冠状病毒抗体的试剂盒包括采用所述多肽包被的ELISA板条。本发明于检测猪Delta冠状病毒抗体的多肽,制备方法简单、巧妙,该多肽免疫反应性良好。本发明检测猪Delta冠状病毒抗体的试剂盒,操作简单、耗时短、特异性高、敏感性高、准确性高、重复性好。