本发明涉及一种特异检测Ⅰ群禽腺病毒PCR检测试剂盒及其检测方法。所述检测试剂盒包括:Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液、10×PCR buffer for UNG plus、热启动型DNA聚合酶、dU plus dNTP mix、尿嘧啶DNA糖基化酶、阳性质控品和阴性质控品;其中,所述Ⅰ群禽腺病毒PCR反应液包括:浓度为5μM的上游引物,其序列为5‘‑ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG‑3’;浓度为5μM的下游引物,其序列为5‘‑GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG‑3’。使用上述PCR检测试剂盒进行检测时,PCR扩增反应的条件为:25℃UNG处理10min,95℃预变性2min;98℃变性10s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸10min。本发明的试剂盒具有灵敏度高(稀释到1:105仍然为阳性)、重复性好的特点,且操作简单、方便快捷,适合Ⅰ群禽腺病毒病的早期诊断,能够及时满足疾病防控的需求。