本发明属于生物疫苗的技术领域,具体涉及一种新型冠状病毒RBD融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用,所述RBD融合蛋白由包括新型冠状病毒S蛋白的RBD结构域、HBM分泌信号肽、flag免疫增强肽、hFc免疫增强肽融合而成,融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述亚单位疫苗为RBD融合蛋白通过杆状病毒昆虫细胞表达系统表达得到,之后进行提纯纯化;新型冠状病毒RBD融合蛋白有助于形成预防新型冠状病毒的疫苗药物,为预防新型冠状病毒感染具有重要意义,本发明通过对疫苗的提取纯化,获得高纯度、高回收率的纯的新型冠状病毒RBD融合蛋白亚单位疫苗,可实现产业化生产。