The present invention relates to: a novel Clostridium butyricum KNU-L09 strain (Accession No. KCTC 12975BP) having antagonistic ability against pathogenic microorganisms a microorganism preparation using the same and a manufacturing method thereof. As a result of experimentally confirming that the novel strain of the present invention has the antagonistic ability against the pathogenic microorganisms, the novel strain of the present invention can be usefully used as an environmentally friendly microorganism preparation for intestinal regulation. Further, since the safety was confirmed through whole gene sequence analysis of the strain, the novel strain can be safely used as the microorganism preparation for a person as well as a livestock.COPYRIGHT KIPO 2017본 발명은 병원성 미생물에 대한 길항능을 가지는 신규한 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum) KNU-L09 균주(수탁번호 KCTC 12975BP), 이를 이용한 미생물 제제, 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 상기 신규 균주는 병원성 미생물에 대한 길항능을 가지는 것을 실험적으로 확인하였는바, 정장작용을 위한 친환경 미생물 제제로써 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 균주의 전체 유전자 서열 분석을 통해 안전성을 확인하였으므로, 가축뿐만 아니라 인간에게도 정장용 미생물 제제로써 안전하게 이용될 수 있는 장점이 있다.