本发明涉及一种HER2 CAR重组慢病毒载体及其构建方法与应用,其中CAR结构基因的核苷酸序列如SEQ ID 1所示;通过将抗HER2 ScFV基因和CAR结构基因进行拼接,得到HER2 CAR基因,其核苷酸序列如SEQ ID 3所示;将Pre‑Lenti‑EF1‑MCS载体和HER2 CAR基因重组构建,得到HER2 CAR重组慢病毒载体,核苷酸序列如SEQ ID 4所示。本发明提供的HER2 CAR重组慢病毒载体,通过包装成HER2 CAR慢病毒并感染新鲜分离的T细胞,制备得到的HER2 CART可以有效杀死A431靶细胞,明显抑制肿瘤细胞的生长,可以用于制备抗肿瘤药物。