本发明提供了一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用,所述制备方法包括:1)将如SEQ ID NO.4所示的基因序列克隆到真核表达载体中,得到含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒;2)再将含有融合蛋白tG编码基因的重组质粒转染至表达细胞中;3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述表达细胞,得到高度表达的细胞株;4)发酵培养步骤3)中所述细胞株,纯化后,得到亚单位融合蛋白tG。本发明能够在大量可溶性表达tG,蛋白稳定,克服了现有技术中狂犬病毒表面G蛋白不能大规模表达等诸多问题,且制备方法简单、成本低。