本发明提供了利用肿瘤特异性启动子介导的PE38KDEL基因表达质粒的构建方法及应用,属于基因靶向治疗肿瘤技术领域,所述PE38KDEL基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明提供了一种含有所述PE38KDEL基因的重组质粒,所述重组质粒以pGL3‑Basic为原始质粒,在pGL3‑Basic的多克隆位点插入肿瘤特异性启动子,并利用PE38KDEL基因替换原荧光素酶基因;所述肿瘤特异性启动子为SERPINB3启动子或CEACAM6启动子。本发明的重组质粒能够靶向性抑制和杀伤肿瘤细胞,从而可以应用于肿瘤靶向基因治疗药物的制备,能够为肿瘤靶向基因治疗提供一种新的手段。