本发明公开了一种检测导致鸭脾脏坏死的新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒。所述荧光定量PCR试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物和SEQ ID NO.3所示的探针,以及标准品和荧光定量PCR反应试剂。本发明的荧光定量PCR试剂盒可以对该新型鸭呼肠孤病毒进行检测,该试剂盒的特异性强,只与新型鸭呼肠孤病毒特异性结合,与其他鸭源病毒都没有交叉反应;而且检测的灵敏度高,在标准品为4×101‑4×109拷贝范围内都有极好的线性关系,检测范围可达9个数量级,可以高效检测新型鸭呼肠孤病毒病鸭组织以及无临床症状的病毒携带鸭,提高了检测效率。