本发明属于分子生物学和生物技术领域,具体涉及一种黄瓜CsMLO1基因及其沉默表达载体构建方法、应用,黄瓜响应棒孢叶斑病调控途径中的CsMLO1基因的全长编码区序列如序列表SEQ ID NO.1所示;氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明还提供将黄瓜CsMLO1基因特异片段插入沉默表达载体pTRV2的构建方法,将构建的植物沉默表达载体经农杆菌转化到黄瓜子叶,获得转基因黄瓜植株并开展抗病性鉴定,结果表明该基因是黄瓜与棒孢叶斑病互作中的负调控因子。本发明为利用基因工程技术,为全面揭示黄瓜CsMLO1基因功能研究提供了技术手段与理论依据,具有很大的应用价值。