本发明公开了一种重组溶瘤痘苗病毒及其制备方法与应用,所述病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)区包含SEQ ID NO.1所示的PD1全长抗体的编码序列。本发明将基因治疗的抑瘤效果与病毒治疗的溶瘤效应有效结合起来,制备了一种可高效表达PD1全长抗体基因的溶瘤痘苗病毒。在溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时,大量表达PD1全长抗体,抑制T细胞表面PD1的活性,激活T细胞免疫应答,发挥双重的抗肿瘤效果。相对于单纯的基因疗法或者病毒疗法增强了其对恶性B细胞淋巴肿瘤的杀伤能力。采用病毒复制相关基因缺失的方式,缺失痘苗病毒基因组的TK区,确保病毒在异常增殖的肿瘤细胞内特异性复制,而在正常的细胞中则不能复制,大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。