本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒检测用三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。所述检测试剂盒包括三重荧光PCR检测混合液、阴性对照品和阳性对照品;其中,所述三重荧光PCR检测混合液中含有分别用于扩增、检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生症病毒的三对引物及其各自对应的探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑9所示。利用本发明的试剂盒和引物探针能快速检测J亚群禽白血病、马立克和网状内皮组织增生病病毒,具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点;及时发现和确诊可疑病例,提高对三种肿瘤病的监测水平。